CRISPRの歴史_3 - Bio-Station

今回はCas9の改変体について。

CRISPR-cas9は強力なゲノム編集技術だが、もちろん課題もある。

その一つが、ターゲット配列にかかる制限だ。

Cas9はガイドRNAで標的とした領域すべてを切断できるわけではなく、

標的配列の近傍にPAM(プロトスペーサー隣接モチーフ)が必要である。

現在広く使われているCas9のPAM配列はNGG(Nは任意の塩基)で、

この配列が近くにないとCas9はDNAを切断できない。

GGは一応1/16で出てくるが、ノックインなどをしようと考えると、

PAMは短い方が望ましい。

そこでPAMを短くしようという試みが行われてきた。

その結果、PAMを1塩基まで絞った論文が今年Science(1)とNature(2)に報告された。

Scienceは日本人(濡木研)なので今回はこちらを主に紹介したい。

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PAMを短くするためには、

NGGの最後のGを認識するアミノ酸を削ればいいだろう、と当然考えられた。

結晶構造解析から、このアミノ酸は同定されていたが(R1335)、

この変異体(R1335A)はDNA切断活性が失われていた。

これは、おそらくDNAとCas9の相互作用が弱くなったためと予想された。

そこで次に、R1335Aのまま、DNAの周りの残基をArgにして

DNA-Cas9相互作用を高めようとした。

実際この変異で、DNAは切断されたがその活性は弱いことが分かった。

そこでさらに、DNAのリボース部分とCas9の相互作用を強めるような変異を導入し、

最終的に、VRVRFRRという7重変異体Cas9がNGをPAMとすることが分かった。

さらに、このCas9はオフターゲット(期待しないDNA領域の切断)も小さいことが分かった。

(これは、このCas9がこれまでのCas9より切断効率が若干劣ることに由来するのかな)

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Natureの方は、西川先生も紹介されています(http://aasj.jp/news/watch/8205)。

基本的には、試験管内で進化を模倣させることで短いPAMを持つCas9を作るというもの。

David Liuというイケイケの研究者のラボから出ていてxCas9と名づけている。

David Liuの他の仕事についてはいつか紹介するかもしれない。

分子進化という方法は初めて知ったので、テクニックは面白いと思った。

ただ、濡木研の論文曰く濡木研Cas9の方がイカしているらしい。

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ちなみに、自分は今のPAMだって2塩基だし結構十分じゃないかと思っていた。

ただそれは、西川先生曰く「PAMだって２塩基だけの制限と思って満足している凡人」らしい。

PAMがNA、NT、NCのものができれば実質的にはPAM freeな感じになるな。

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参考

(1) Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space, Science, 2018

(2) Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity, Nature, 2018

関係者の方、間違い等ありましたら教えてください。